Control de la expresióngénica en procariontes: el operón

18.1. Responda razonadamente a las siguientes preguntas:

•  ¿Por qué las mutaciones I - del operón lactosa de E. coli son recesivas frente a las
I + ?

•  ¿Por qué las mutaciones I' son dominantes sobre las I'?

•  ¿Qué significa que las mutaciones O ' del operón lactosa son dominantes en cis?

Solución

•  Las mutaciones I - del oper ón lactosa afectan al gen regulador que lleva información pa­-
ra la proteína represora que se une al operador. listas mutaciones que afectan al gen
regulador dan lugar a un represor no funcional y son mutaciones constitutivas de ma­
nera que los genes estmcturales del operón lactosa se transcriben constantemente, tan-­
to en presencia como en ausencia del inductor (alolactosa). La estructura cuaternaria
activa del represor es tetramérica (cuatro cadenas polipeptídicas), de manera que estas
mutaciones pueden afectar a la capacidad de formar tetrámeros de manera que no se
forma un represor activo capaz de reconocer a la región operadora. Estas mutaciones
son recesivas en los diploides parciales I + /I-, ya que a partir del gen regulador normal
se sintetizan polipéptidos represores que son funcionales, pues adquieren la estructu-­
ra tetramérica normal del represor. Estos represores funcionales, al ser proteínas difu­
sibles (actúan en posición trans), se unen a las dos regiones operadoras existentes en
el diploide parcial.

•  Las mutaciones I s (superreprimidas) afectan tambi én al gen regulador, de manera que
modifican la región encargada de reconocer y unirse al inductor (alolactosa). La proteí­-
na represora, como ya hemos dicho, es un tetrámero y se puede unir a cuatro molécu-­
las de alolactosa o del análogo IPTG. Esta unión con la alolactosa determina que el
represor se suelte del operador y que tenga lugar la transcripción de los genes estruc­-
turales del operón lactosa. Las mutaciones I s dan lugar a proteínas represoras que, al no
reconocer al inductor (alolactosa), son incapaces de soltarse del operador y, como con­
secuencia, la ARN-polimerasa no puede unirse al promotor y nunca se transcriben los genes estructurales del oper ón lactosa, de ahí su nombre cíe mutaciones superreprimi­ das. Estas mutaciones se comportan como dominantes en los diploides parciales I + /I s ya que los represores mutantes producidos a partir del gen I s son proteínas difusibles que pueden ejercer su efecto sobre otras moléculas de ADN (posición trans) y que co­ pan los dos operadores y los monopolizan, de forma que no se sueltan e impiden que la ARN-polimerasa pueda transcribir los genes estructurales.

c) Los mulantes O c (operador constitutivo) llevan mutaciones en la regi ón operadora de manera que está alterada su secuencia de bases y la proteína represora no es capaz de reconocer al operador mutante. Como consecuencia los genes estructurales se están transcribiendo de forma constitutiva, es decir, tanto en ausencia como en presencia del inductor (alolactosa). Dado que estas mutaciones (O c ) afectan a la secuencia de bases de la región operadora, región del ADN que no codifica para proteína alguna o pro­ducto difusible, estas mutaciones sólo ejercen su efecto sobre los genes estructurales que están situados sobre la misma molécula de ADN que tiene la mutación en el ope­ rador (posición cis), no pudiendo ejercer efecto alguno sobre los genes estructurales si­ tuados sobre otra molécula diferente de ADN (posición trans). Por este motivo, las mutaciones O c se dice que son dominantes en cis en los diploides parciales.

18.2. Los mulantes del operón lactosa que afectan al gen estructural de la ß-galaclosi dasa pueden sintetizar la permeasa; sin embargo, a pesar de que estos mutantes tie­ nen un gen regulador (I) normal, la permeasa no puede ser inducida añadiendo lactosa al medio. De igual forma, los mulantes del operón lactosa que afectan al gen estructural de la permeasa pueden sintetizar ß-galactosidasa, sin embargo, a pesar de que estos mutantes tienen un gen regulador (I) normal, la ß-galactosida sa no puede ser inducida añadiendo lactosa al medio. ¿Podría explicar estos resultados?

Solución

Los mulantes que afectan al gen de la ß-galactosidasa no pueden ser inducidos a ña­diendo lactosa al medio, ya que la permeasa transporta la lactosa al interior de la célula bacteriana, pero al carecer de ß-galactosidasa no puede escindir la lactosa en glucosa y alolactosa, de manera que la alolactosa, que es el verdadero inductor del sistema, no se produce y, como consecuencia, la proteína reguladora no se suelta del operador y no se transcriben los genes estructurales.

Los mutantes que afectan al gen estructural de la permeasa carecen de permeasa acti­ va, enzima que transporta la lactosa al interior de la bacteria y, por tal motivo, no pueden introducir la lactosa del medio en el interior c íe la célula bacteriana. La consecuencia es que estos mutantes no pueden ser inducidos mediante lactosa, ya que ésta no entra en la bacteria y la proteína reguladora permanece unida al operador impidiendo la transcripción de los genes estructurales.

La existencia de este tipo de mutaciones es lo que ha hecho que en los estudios del ope­ r ón lactosa se emplee un análogo de la alolactosa que es el isopropil tiogalactosido (IPTG).

Este an álogo de la alolactosa entra en el interior de la bacteria sin necesidad de un enzima que lo transporte y es reconocido por la proteína represora sustituyendo a la alolaclosa.

18.3. Algunas mutaciones del gen regulador (I - ) afectan a la capacidad de uni ón del represor a la región operadora, pero no afectan a la capacidad para formar tetrá­meros, que es la estructura cuaternaria activa del represor. Estas mutaciones I - son parcialmente dominantes sobre las I+. ¿Podría explicar a qué se debe la dominancia parcial de estas mutaciones I -?

Solución

Algunas mutaciones I- afectan al gen regulador que lleva informaci ón para la proteína represora en la zona que reconoce a la región operadora. En concreto, estas mutaciones afectan al extremo NH 2 del polipéptido que constituye el represor. Estas mutaciones tam­ bién reciben el nombre de I -d y se ha comprobado que en los diploides parciales (I + /I -d ) pueden comportarse como dominantes. El comportamiento dominante sobre I + se debe a la estructura cuaternaria activa de tipo tetramérico (cuatro cadenas polipeptídicas) del re­presor. En el diploide parcial se pueden formar 5 tipos diferentes de tetrámeros activos, homotetrámeros formados por cuatro polipéptidos idénticos de tipo normal (a + a + a + a + ), homotetrámeros con cuatro polipéptidos idénticos de tipo mutante (a-a-a-a-) y tres tipos diferentes de heterotetrámeros formados por cadenas polipeptídicas normales y de tipo mulante (a + a + a + a-; a + a + a-a- y a + a-a-a-). Todos estos tipos de tetrámeros se producen de­ bido a que la mutación no afecta a la región del polipéptido que interviene en la forma­ ción de la estructura tetramérica. Si existe igual cantidad de polipéptido normal y polipéplido mutante y éstos se asocian al azar para formar tetrámeros, la probabilidad de los diferentes tipos de tetrámeros es de 1/16 para cada uno de los homotetrámeros, de 4/16 para los heterotelrámeros a + a + a + a- y a + a-a-a-, y de 6/16 para el heterotetrámero a + a + a-a-. Por consiguiente, excepto el homotetrámero que tiene las cuatro cadenas poli­peptídicas de tipo normal (a + a + a + a + ) y que aparece con una probabilidad de 1/16, todos los demás poseen cadenas polipeptídicas mutantes y su probabilidad global es de 15/16, siendo mucho más frecuentes que los represores normales y siendo ésta la causa de la do­ minancia en los diploides parciales de este tipo de mutaciones.

Si existe igual cantidad de a + que de a - y ambos polip éptidos se asocian al azar para formar tetrámetros activos, la mayor parte de los tetrámetros tiene cadenas polipeptídicas mutante

18.4. Una mutaci ón afecta a la región promotora (P-) del ADN del operón lactosa de manera que la ARN-polimerasa no es capaz de unirse al promotor. ¿Qué comportamiento tendrá está mutación en un diploide parcial P+/P-?

Solución

Las mutaciones que afectan a la regi ón del ADN que es reconocida por la ARN-poli­merasa (P- ) tienen como consecuencia que los genes estructurales que están bajo el con­ trol de ese promotor nunca se transcriben, ya que la ARN-polimerasa no es capaz de reconocer y unirse al promotor para comenzar a transcribir. Por tanto, son mutantes que están constantemente reprimidos y en los que no se transcriben los genes estructurales nunca (ni en presencia, ni en ausencia de inductor). Estas mutaciones son dominantes en cis en los diploides parciales P+/P-, ejerciendo su efecto sobre todos aquellos genes es­ tructurales que estén situados en la misma molécula de ADN que lleva la mutación en el promotor, pero no sobre los genes estructurales que están situados en otra molécula de ADN diferente (posición trans).

18.5. Explique las diferencias fundamentales entre control positivo y control negativo.
Solución

En el control positivo existe una prote ína que activa o estimula la transcripción. Esta proteína activa la transcripción por interacción con la ARN-polimerasa, estimulando su unión al promotor, de manera que aumenta la tasa de transcripción.

En el control negativo hay una prote ína represora que se une a la región operadora e impide la transcripción de los genes estructurales, ya que al estar unida al operador, ocu­pa parte de la región promotora e impide que la ARN-polimerasa pueda entrar a recono­cer el promotor, y, como consecuencia, no se transcriben los genes estructurales.

18.6. En el operan triptófano de E. coli, ¿cómo se podría distinguir entre una mutación
O c (operador constitutivo) y una mutación que afecte al gen regulador R- (regula­-
dor constitutivo)?

Solución

El oper ón triptófano de E.coli es de tipo represible y está bajo control negativo, de ma­nera que en una bacteria normal cuando los niveles de triptófano (correpresor) son altos, el propio triptófano se une al represor producido por el gen R, cambia su conformación, y aho­ ra el represor unido al triptófano reconoce la región operadora e impide la transcripción de los genes estructurales. Sin embargo, cuando los niveles de triptófano son bajos, el represor no es capaz de unirse al operador y tiene lugar la transcripción de los genes estructurales.

Un mutante O c (operador constitutivo) presentar ía siempre transcripción de los genes estructurales, tanto en presencia de niveles altos como bajos de triptófano. De igual forma, una mutación que afecte al regulador R- produciría un represor incapaz de reconocer a la región operadora y los genes estructurales se transcribirían de forma constitutiva, en pre­ sencia de niveles altos o bajos de triptófano.

Estas mutaciones se podr ían distinguir empleando diploides parciales (O+/O c y R + /R - ), de manera que las mutaciones en el operador (O c ) serían dominantes en cis, mientras que las mutaciones R - serían recesivas.

18.7. Indique los enzimas que producir án los siguientes diploides parciales para el siste­-
ma enzimático del operón lactosa de E. coli:

a) I+O c Z+Y-/ I-O+Z-Y-

b) I+OcZ-Y+/I+O+Z+Y-

•  I+OcZ-Y-/I-OcZ-Y-

•  I + O c Z + Y + /I - O + Z - Y +
Solución

El gen estructural Z produce (ß-galactosidasa y el gen estructural Y codifica para permeasa. La regi ón O corresponde al operador y el gen I lleva información para la proteína represora. El operón lactosa es un sistema inducible (el inductor es la lactosa) bajo control negativo (prote ína represora). Las mutaciones O c son dominantes en cis (ejercen su efec­ tos sobre los genes estructurales situados en la misma molécula de ADN en que está la mu­ tación del operador), mientras que las mutaciones I- son recesivas en los diploides parciales I+/I-, ya que la proteína represora es difusible y puede ejercer su efecto sobre operadores situados en otra molécula de ADN (posición trans).

En la siguiente tabla se indican las enzimas que se sintetizar ían en cada uno de los di­ploides parciales en presencia y en ausencia de lactosa:

•  El diploide parcial I+OcZ+Y-/I-O+Z-Y+ produce de forma constitutiva P-galactosidasa ya
que este gen estructural est á en la misma molécula de ADN que el operador constituti­
vo Oc. La permeasa producto del gen Y solamente se produce en presencia del induc­
tor lactosa, ya que cuando la lactosa está ausente la proteína represora producto del
gen I+ está unida al operador O+ y no se transcribe el gen estructural Y+.

•  El diploide parcial I+OcZ-Y+/I+O+Z+Y- produce permeasa de forma constitutiva, tanto en
presencia como en ausencia de lactosa, ya que el gen Y+ est á en la misma molécula de
ADN que el operador constitutivo Oc (dominancia en cis). La ß-galactosidasa se pro­
duce en presencia del inductor lactosa pero no en su ausencia, ya que en ausencia de
lactosa la proteína represora producto del gen I+ estaría unida al operador O+ y no se
transcribirá el gen Z+; sin embargo, en presencia de lactosa, ésta se unirá al represor
que dejara libre el operador O+ y se transcribirá el gen Z+.

•  El diploide parcial I+OcZ-Y-/I-OcZ-Y+ sintetiza de forma constitutiva (en presencia y en
ausencia de lactosa) la permeasa producto del gen Y+ que est á en la misma molécula
de ADN que el operador constitutivo O c (dominancia en cis). La otra enzima, la ß-ga-
lactosidasa, no se produce nunca, ya que el diploide parcial tiene los dos genes es­
tructurales mulantes (Z-).

•  En el diploide parcial I+OcZ+Y+/I-O+Z-Y+ los dos enzimas, ß-galactosidasa y permeasa se
producen de forma constitutiva, ya que existen dos genes estructurales normales (Z+ e
Y+) en la misma mol écula de ADN que un operador constitutivo Oc (dominancia en cis).

18.8. En E. coli existe un oper ón de control positivo que regula la síntesis de dos enzi­ mas El y E2 que actúan sobre el mismo sustrato. Para determinar la función de los distintos genes implicados en el sistema, se ha estudiado el comportamiento en presencia y ausencia del sustrato de diferentes estirpes haploides y diploides par­ ciales que presentaban mutaciones en cuatro loci relacionados con este operan. Los resultados obtenidos se indican en la siguiente tabla:

•  ¿Es un sistema inducible o represible?

•  ¿Cuál es la función de los genes A, B, C y D?

Solución

•  Se trata de un sistema inducible, ya que las bacterias normalesA + B + C + D + producen los
enzimas El y E2 en presencia del sustrato pero no en su ausencia.

•  Un oper ón con control positivo significa que existe una proteína que estimula la trans-­
cripción. En presencia de sustrato el activador promueve la transcripción de los genes
estructurales, mientras que en su ausencia no es capaz de estimular la transcripción.
Las bacterias A - B + C + D + no producen ni El ni E2, la mutación del gen A debe afectar a
la proteína activadora que estimula la transcripción. Por tanto, A es el regulador o acti­
vador. Estas mutaciones son recesivas en los diploides parciales. También podría tra­
tarse de una mutación en el promotor.

Las colonias A + B + C - D + producen de manera constitutiva los enzimas El y E2, siendo la mutaci ón C una mutación que cambia la secuencia del operador (O c ). Este tipo de mu­ taciones presentan dominancia en cis.

Las estirpes A + B - C + D + producen E2 de forma normal, pero no sintetizan nunca E1 es­tando, por consiguiente, su mutaci ón en el gen estructural E1; por tanto, B es el gen es­ tructural El. La cepaA+B+C+D-produce de manera normal El, y E2 no lo sintetiza nunca, teniendo lógicamente una mutación en el gen estructural E2; por consiguiente, D es el gen estructural E2.

Los diploides parciales pueden confirmar las deducciones realizadas en las anteriores estirpes bacterianas:

El diploide parcial A+B+C+D-/F'A-B-C+D+ debe producir El y E2 en presencia de induc­ tor y no en su ausencia, ya que A+ domina sobre A- (mutaci ón proteína activadora), ac­ tuando la proteína activadora normal sobre ambas moléculas de ADN (posición trans) y estimulando la transcripción de los genes estructurales B+ (El) y D+ (E2). Igualmente, se deduce que A- no puede ser una mutación en el promotor.

El diploide parcial A+B+C-D-/F'A+B-C+D- tiene un operador constitutivo C- y deber ían transcribirse constantemente los genes estructurales que están en su misma molécula de ADN (dominancia en cis), de manera que producirá constitutivamente E1 (B+).

El enzima E2 no puede sintetizarlo correctamente, ya que ambos genes estructurales son mutantes (D- ).

Por último, el diploide parcial A+B-C-D+/F"A+B-C+D- tiene una mutación en el operador C y transcribirá de forma constitutiva todos los genes que estén en la misma molécula de ADN (dominancia en cis), produciendo siempre E2. El enzima El no se puede sin­tetizar de manera correcta debido a que los dos genes estructurales para El (B) son mu­lantes.

18.9. En una determinada especie bacteriana los genes A, B y C está n implicados en la expresión de un sistema enzimático represible de control negativo, responsable de la síntesis del enzima E.

Se han aislado tres mulantes A-, B- y C- y se ha comprobado la presencia del en­zima E en presencia y en ausencia del correpresor, en cada una de las cepas mu­tantes y en cuatro diploides parciales. Los resultados obtenidos se indican en la siguiente tabla:

¿Cuál es la función de cada uno de los genes A, B y C?

Solución

En un sistema enzim ático represible de control negativo como el del operen triptófa no, cuando el correpresor (triptófano) está presente a niveles altos se une a la proteína re­ guladora y ésta cambia su conformación y se une al operador, bloqueando la transcripción de los genes estructurales. En ausencia de correpresor (triptófano) o a niveles muy bajos la proteína represora no se une al operador y tiene lugar la transcripción de los genes es­tructurales.

La cepa A-B+C+ posee una mutaci ón que impide la síntesis del enzima E tanto en pre­ sencia como en ausencia de correpresor; por tanto, debe ser una mutación que afecte al gen estructural, de manera que A debe ser el gen estructural para el enzima E.

La estirpe A+B-C+ tiene una mutaci ón de tipo constitutivo al igual que las bacterias A+B+C-; por consiguiente, se trata de una mutación en el gen regulador, de manera que la proteína reguladora es incapaz de unirse al operador en ausencia o presencia del corre­ presor; como consecuencia, los genes estructurales se transcriben constantemente. Estas mutaciones son recesivas frente a las normales. También podría tratarse de una mutación operador constitutivo, de forma que siempre se est án transcribiendo los genes estructura­ les que están en la misma molécula de ADN que esta mutación (dominancia en cis). l.os genes B y C son el operador y el regulador, o al contrario, ya que con los datos que hemos deducido hasta el momento no es posible saberlo.

A partir de los diploides parciales podemos deducir si el gen B es el operador y el C el regulador o viceversa.

En el diploide parcial A+B+C+/F'A-B-C- no es posible deducir si B o C son el regulador y el operador o viceversa, ya que ambas mutaciones est án sobre la misma molécula de ADN y además también está mutado el gen estructural A.

En el diploide parcial A+B+C-/F'A-B-C+ si C fuera un operador constitutivo el gen es­ tructural A+ (normal) situado sobre la misma mol écula de ADN que el mulante C- debe­ ría transcribirse de forma constitutiva, produciéndose el enzima en presencia y en ausencia de correpresor. Sin embargo, esto no es lo que sucede; por tanto, C no puede ser el operador, siendo el regulador. Si B es el operador y C es el regulador, el enzima E se produciría en ausencia de correpresor y no se formaría en su presencia, ya que la mu­ tación b- (operador constitutivo) está situada en la misma molécula de ADN que tiene una mutación en el gen estructural A (enzima E). Estos resultados coinciden con los expues­tos en la tabla.

En los dos diploides parciales restantes podemos comprobar que C es el regulador y B el operador. En el diploide parcial A+B-C+/F'A-B+C- si B es el operador se deber ía expre­ sar de forma constitutiva (en presencia y en ausencia de correpresor) el enzima E, ya que la mutaci ón B (operador constitutivo) ejerce su electo sobre los genes estructurales que están en su misma molécula de ADN (dominancia en cis), en este caso sobre A'.

Por último, en el diploide parcial A-B+C+/F'A+B-C- el enzima E se debería sintetizar de forma constitutiva (siempre) si B es un operador constitutivo, ya que el gen estructural A (enzima E) que está en la misma molécula de ADN se expresaría siempre. Por tanto, estos datos coinciden con los expuestos en la tabla. Sin embargo, este diploide parcial no nos permite distinguir si B es el operador constitutivo o lo es el gen C, ya que ambos están imi­ tados sobre la misma molécula de ADN.

De los cuatro diploides parciales solamente dos nos permiten asegurar que B es el ope­ rador y C es el regulador, estos diploides parciales son: A+B+C-/F'A-B-C+ y A+B-C+/F' A-B+C-.